• Shameik Moore vai Miles Morales / Spider-Man:
  Một thiếu niên thông minh và nổi loạn người Mỹ gốc Phi và Puerto Rico, bỗng nhiên có được khả năng giống loài nhện sau khi bị một con nhện nhiễm phóng xạ cắn vào tay; từ đó cậu giữ vai trò tiếp nối sứ mệnh của người anh hùng Spider-Man đã khuất.[10] Hai nhà sản xuất Lord và Miller coi Miles là nhân vật độc đáo nhất trong số các Spider-Man, "đó là vì cậu ấy lớn lên tại Brooklyn, đó là vì văn hóa của cậu ấy. Cậu ấy nửa Puerto Rico, nửa Mỹ gốc Phi, cậu ấy là sản phẩm của một gia đình hạnh phúc và vẫn còn sống nhăn".[11] Đạo diễn Persichetti cho biết, Moore sở hữu "chất giọng độc đáo, đặc trưng và đầy quyến rũ, đem đến sự ngây thơ nhưng cũng rất chân thật."[12] Riêng đối với Moore, việc vào vai Miles trở nên đơn giản hơn vì nhân vật này "giống hệt tôi ở trong gương", đồng thời anh cũng cho rằng mình "có rất nhiều điểm chung với cậu ấy mà đôi khi tôi chỉ đơn giản là biến hóa giọng nói của mình theo cách mà họ muốn tôi thể hiện mà thôi."[12][13]
• Jake Johnson vai Peter B. Parker / Spider-Man:
  Bản sao 38 tuổi luôn chán nản và mệt mỏi của Spider-Man tới từ chiều không gian khác,[14] đồng thời cũng là người hướng dẫn bất đắc dĩ của Miles.[15] Theo Miller, Parker chính là "sự kết hợp của tất cả các [hình mẫu về] nhân vật Spider-Man trong văn hóa đại chúng". Cả Lord và Miller đều hình dung nhân vật này sẽ giống với một phiên bản thiếu hiểu biết của Mr. Miyagi trong The Karate Kid.[16] Đối với chính Johnson, nhân vật của anh lại là "một Peter Parker đậm tính người", và "khi mọi người gặp Peter, cậu ấy sẽ không bay lượn từ tòa nhà này tới tòa nhà khác, cứu người gặp nạn và lộn ngược đầu hôn MJ đâu. Trái tim cậu ấy đang vỡ vụn vì những quyết định cậu ấy đã lựa chọn."[17]
• Hailee Steinfeld vai Gwen Stacy / Spider-Woman:
  Một Gwen Stacy tới từ chiều không gian khác, sở hữu khả năng giống như loài nhện. Cô sử dụng cái tên "Wanda" (đọc chệch từ "Gwanda") khi hòa nhập tại trường trung học của Miles.[18] Steinfeld nhận xét Gwen Stacy là "một người thủ lĩnh có tâm hồn tự do, can đảm, dí dỏm và đầy bản năng", đồng thời cũng "biết điều mình cần phải làm và cách thực hiện nó, cô ấy thực sự [là một người] truyền cảm hứng."[19]
• Mahershala Ali vai Aaron Davis / Prowler:
  Chú của Miles và cũng là người hành pháp của Kingpin.[20] Ali cho rằng nhân vật mà anh lồng tiếng là "một trong những nhân vật phức tạp và hấp dẫn nhất mà tôi gặp, ở cả truyện tranh lẫn trong phim hoạt hình" và miêu tả mối quan hệ giữa Davis và Miles là "cấu thành cảm xúc quan trọng của bộ phim."[21]

• Brian Tyree Henry vai Jefferson Davis:
  Bố của Miles, một cảnh sát luôn coi Spider-Man là một mối nguy hại.[20] Ở tuổi 35, Henry cho rằng anh còn quá trẻ để vào vai bố của một thiếu niên, nhưng lại đồng ý tham gia vai diễn sau khi biết Miles Morales là Spider-Man người Latinh da màu duy nhất.[5] Với anh, một trong những phân cảnh ấn tượng nhất là khi Davis tới nói chuyện với con trai mình ở bên kia cánh cửa phòng trọ, mà anh cho biết khi lồng tiếng cho phân đoạn này, "nỗi đau mà tôi chia sẻ là có thật."[22]
• Lily Tomlin vai May Parker:
  Dì của Peter Parker đã mất, bà cung cấp nơi ẩn náu cho các Spider-Man từ chiều không gian khác bị lạc tới vũ trụ của Miles.[18] Về nhân vật của mình, Tomlin cho biết: "Bà ấy là người có trái tim nhân hậu, nhưng cũng rất cứng rắn,"[23] và "thật đáng yêu, thân thuộc và cũng thật mâu thuẫn khi mọi người đều cố gắng tự giải quyết các vấn đề của bản thân mình. Họ không làm điều đó theo một cách đơn giản. Và khi họ tới gặp dì May, bà ấy sẽ luôn sẵn sàng cưu mang và hỗ trợ họ."[24]
• Luna Lauren Velez vai Rio Morales:
  Mẹ của Miles, một điều dưỡng viên.[18] Velez nhận xét về nhân vật của mình là "đanh đá. [...] Cô ấy rất là độc lập. Cô ấy là người phụ nữ của sự nghiệp. Cô ấy là người phụ nữ của gia đình. Tất cả những điều ấy đều vô cùng quan trọng, và cô ấy cùng thật mạnh mẽ."[25]
• Zoë Kravitz vai Mary Jane Watson:
  Người vợ góa của Peter Parker đã khuất trong vũ trụ của Miles, đồng thời cũng là vợ cũ của Peter B. Parker trong vũ trụ của anh.
• John Mulaney vai Peter Porker / Spider-Ham:
  Phiên bản động vật ngộ nghĩnh của Spider-Man xuất thân từ một vũ trụ nhân hóa, cậu trước đây vốn là một con nhện bị cắn bởi một con lợn nhiễm phóng xạ.[26][27] Mulaney cho biết khi anh được giao vai trò lồng tiếng cho Spider-Ham, anh không hề biết tên bộ phim là gì cũng như kịch bản phim sẽ như thế nào; dù vậy anh vẫn được khuyến khích "cứ vui đùa [với việc lồng tiếng] đi, và cứ tự thêm những lời thoại của riêng mình vào."[28]
• Kimiko Glenn vai Peni Parker / SP//dr:
  Cô gái trẻ người Mỹ gốc Nhật đến từ vũ trụ anime, cô cùng một con nhện phóng xạ có mối liên kết thần giao cách cảm tham gia điều khiển một cỗ máy cơ sinh học do người bố đã khuất chế tạo ra.[27] Các nhà làm phim ban đầu cân nhắc sử dụng Silk làm Spider-Man người Mỹ gốc Á, nhưng sau đó đã lựa chọn Peni vì khả năng đặc biệt của cô so với các Spider-Man khác.[29] Thiết kế của Peni trải qua nhiều thay đổi vì phiên bản ban đầu của cô bị cho là "không chắc chắn." Nhà thiết kế sản xuất Justin Thompson đã cân nhắc mong muốn của Lord và Miller trong việc sử dụng thiết kế anime và cuối cùng đã thể hiện hình ảnh của Peni theo phong cách giống với bộ manga Thủy thủ Mặt Trăng.[30]
• Nicolas Cage vai Peter Parker / Spider-Man Noir:
  Phiên bản Peter Parker đen tối và đơn sắc đến từ vũ trụ thập niên 1930.[31] Cage, người đã từng làm việc với Marvel trong tác phẩm Ma tốc độ, đã lấy cố diễn viên Humphrey Bogart làm hình mẫu để thể hiện nhân vật này, đồng thời sử dụng giọng của các diễn viên cùng thời như James Cagney và Edward G. Robinson để tham khảo.[32]
• Kathryn Hahn vai Olivia Octavius / Tiến sĩ Octopus:
  Nhà khoa học và CEO của Alchemax, đồng thời cũng là cố vấn khoa học của Kingpin. Phiên bản gốc trong truyện tranh của Doc Ock vốn là đàn ông. Các nhà làm phim ban đầu cũng có dự định đưa phiên bản nam này vào bộ phim, tuy nhiên như Rothman đã giải thích, "Và rồi chúng tôi quyết định biến Doc Ock thành phụ nữ. Chúng tôi đem những yếu tố từ cốt truyện cổ điển của Spider-Man vào đây rồi đảo ngược nó lại."[33]
• Liev Schreiber vai Wilson Fisk / Kingpin:
  Chúa tể tội phạm và nhà tài trợ của Alchemax trong chiều không gian của Miles.[10][18] Schreiber cho biết anh tham gia dự án này là vì con trai mình: "Tôi đã có vài đứa con rồi, vậy nên tôi luôn nói 'đồng ý' tới mọi công việc phù hợp với lứa tuổi dưới 12. Trong vòng 10 hay 15 năm qua, tôi chưa bao giờ thực sự tham gia vào những tác phẩm mà con mình có thể xem được."[34]

Ngoài ra, nam diễn viên Chris Pine cũng tham gia dự án với vai trò lồng tiếng cho phiên bản Peter Parker / Spider-Man tóc vàng ở chiều không gian của Miles, xuất hiện ở đoạn đầu bộ phim.[35] Một số diễn viên lồng tiếng khác trong phim bao gồm: Lake Bell vào vai Vanessa Fisk, Jorma Taccone vào vai Norman Osborn / Green Goblin,[36] Marvin "Krondon" Jones III vào vai Tombstone,[37] Joaquín Cosío vào vai Scorpion,[38] và Post Malone trong vai một người đi đường ở Brooklyn.[39][36] Giọng nói của Cliff Robertson lưu trữ từ tác phẩm Người Nhện 2 được sử dụng trong phân cảnh hổi tưởng về nhân vật Ben Parker.[40] Nhà đồng sáng tạo ra Spider-Man, Stan Lee, cũng xuất hiện trong phim dưới vai một người bán hàng tên Stan. Ông là người đã bán bộ quần áo Spider-Man cho Morales. Lord và Miller cho biết tầm quan trọng của việc cho Lee một khoảnh khắc lớn trong bộ phim thay vì chỉ là một vai diễn khách mời thoáng qua, khi mà ông "đã trở thành linh hồn của bộ phim này," và vai diễn cũng trở nên "vô cùng có ý nghĩa" sau sự ra đi của Lee vào tháng 11 năm 2018.[16][41] Nhân vật của Lee cũng có những lần xuất hiện nhỏ khác xuyên suốt bộ phim, ví dụ như khi ông bước qua phần nền cảnh trong phân đoạn Miles và Peter B. Parker nằm trên đường phố New York.[42][43][44]

Các vai diễn khách mời trong phần post-credits của Người Nhện: Vũ trụ mới bao gồm Oscar Isaac lồng tiếng cho Miguel O'Hara / Spider-Man 2099, một phiên bản khác của Spider-Man xuất hiện trong ấn phẩm Marvel 2099,[45] Greta Lee lồng tiếng cho trợ lý ảo Lyla của O'Hara (cả hai đầu lần lượt được ghi chú ở phần credit là "Người thú vị #1" và "Người thú vị #2"); và Jorma Taccone lồng tiếng cho Peter Parker / Spider-Man từ loạt phim truyền hình năm 1967 (thay thế cho Paul Soles; nhân vật này được ghi chú là "Gã ở cuối phim").[lower-alpha 2][46] Donald Glover cũng xuất hiện trong nền phim trên một màn hình vô tuyến đang chiếu cảnh anh vào vai nhân vật Troy Barnes đang mặc một bộ đồ ngủ hình Spider-Man, phân cảnh này lấy từ một tập phim truyền hình Community mà anh có tham gia diễn xuất.[47] Ganke Lee, người bạn thân cùng phòng Miles Morales cũng xuất hiện trong bộ phim.[48][49] Nhân vật này vốn được giao cho một vai trò lớn hơn, tuy nhiên kịch bản đã bị thay đổi do trong Người Nhện: Trở về nhà đã có một vai diễn tương tự tên Ned.[50] Họa sĩ hoạt hình Pixar Peter Sohn được giao vai trò lồng tiếng cho Ganke trước khi nhân vật này bị cắt khỏi bản phim cuối cùng;[51] các nhà làm phim cũng cho biết Ganke sẽ có nhiều lời thoại hơn trong các phần phim sau.[52]